Phần tiếp theo của Secret of the Tomb, đây là bộ phim hoạt hình đầu tiên trong loạt phim Night at the Museum và là phần thứ tư nói chung. Nick Daley đang tiếp bước cha mình với tư cách là người gác đêm tại Bảo tàng Lịch sử Tự nhiên Hoa Kỳ, vì vậy anh ấy biết điều gì sẽ xảy ra khi mặt trời lặn. Nhưng khi Kahmunrah trốn thoát, Nick phải cứu bảo tàng một lần và mãi mãi.